التقدير الغير مباشر لعدد الخلايا البكتيريه

المجهر

التقدير الغير مباشر لعدد الخلايا البكتيرية
- بهذه الطريقة يمكن تقدير عدد الخلايا الحية القادرة على النمو والتكاثر تحت الظروف المناسبة لنموها
- يجرى ذلك بطريقة العد بالأطباق Plate Count method


طريقة العمل:

1- لديك مزرعة بكتيرية نامية على مرق مغذي, ترج المزرعة جيدا
2- بواسطة ماصة معقمة، ينقل 1 مل من المزرعة الى انبوبة تحتوي على 9مل ماء معقم وترج الأنبوبة ( تخفيف 1:10)
3- ينقل من الأنبوبة السابقة 1مل بواسطة ماصة معقمة أخرى إلى انبوبة بها 9مل ماء معقم وترج الأنبوبة ( تخفيف 1:100 )
4- تكرر الخطوة السابقة عدة مرات للحصول على تخفيفات تصل الى 1: 1000000
5- ينقل 1مل من التخفيفات الثلاثة الأخيرة الى طبق بتري معقم ( طبقين لكل تخفيف)
6- لكل طبق يضاف كمية مناسبة من وسط الاجار المغذي المسالة والمبردة الى 45م ويحرك الطبق
7- تترك الاطباق حتى يتصلب الوسط ثم توضع مقلوبة في الحضان عند 37م لمدة 24ساعة
8- يتم اختيار التخفيف المناسب الذي يظهر به عدد المستعمرات يتراوح بين 30-300 مستعمرة بالطبق الواحد
9- يحسب عدد الخلايا الحية في 1مل من المزرعة الاصلية بضرب متوسط عدد المستعمرات في الطبق في مقلوب التخفيف المستعمل




الصبغ المقاوم للأحماض Acid Fast Stain

- بكتيريا Mycobacterium tuberculosis التي تسبب مرض السل ذات خواص طبيعية او كيميائية يصعب صبغها بالطرق العادية
- اذا تعرض الغشاء للحرارة خلال الصبغ لمدة طويلة نسبيا فانة يصعب ازالة الصبغة حتى لوغسلت بالكحول المحمض ب Hcl فتعرف بانها مقاومة للاحماض Acid fast وبالتالي تحتفظ بصبغة كربول الفوكسين وتظهر الخلايا حمراء اللون
- البكتيريا الغير مقاومة للاحماض Non-acid fast تزال منها الصبغة خلال الغسيل بالكحول المحمض وتتلون بالصبغة العكسية ( مثل ازرق الميتلين)
- الطريقة المستخدمة للصبغ Ziehl & Neelsen

طريقة العمل:

1- يحضر غشاء من المزرعة البكتيرية الحديثة ثم يثبت
2- يغمر الغشاء بصبغة كربول الفوكسين ويسخن السطح السفلي للشريحة حتى يتصاعد منها البخار ( دون غليان الصبغة) لمدة من 3-5 دقائق ( عدم جفاف الصبغة)
3- تغسل الشريحة تحت تيار ماء خفيف
4- يضاف الكحول المحمض على الغشاء نقطة فنقطة تدريجيا مع امالة الشريحة حتى تسقط القطرات عديمة اللون
5- يغسل الغشاء تحت تيار ماء خفيف
6- يصبغ الغشاء بصبغة ازرق الميثلين لمدة دقيقة
7- يغسل الغشاء تحت تيار ماء خفيف
8- تجفف الشريحة ثم تفحص تحت المجهر

الاختلاف بين البكتيريا المقاومة للاحماض والغير مقاومة للاحماض

- يرجع السبب الاساسي للاختلاف الى وجود تراكيز مرتفعة من الدهون في الاغشية السيتوبلازمية لخلايا البكتيريا المقاومة للاحماض، وهذه الدهون تنمنع او تؤخر دخول الصبغة او خروجها
- ويعتقد ان وجود حمض الميكوليك Mycolic acid في البكتيريا المقاومة للاحماض بنسبة كبيرة من اسباب ايجابيتها